Egyre több adat utal arra, hogy diabetes mellitusban az intravascularis EDRF-NO (NO)-képzés csökken, s ez az eltérés hozzájárul a diabeteszes angiopathia patogeneziséhez is. Újabb megfigyelések azt igazolják, hogy érdekes módon a thrombocyták is rendelkeznek indukálható NO-szintetáz (NOS) enzimmel, amelynek működése a thrombocyta-aktivációt előidéző kémiai ingerek hatására indul el. Az így, a vérlemezkében képződő NO mennyisége ugyan csekély, de mégis ott keletkezik az érrendszerben, ahol a thrombus, s valószínűleg gátló hatást fejt ki a vérlemezke-aktivációra, csökkenti az aggregálódó thrombocyták számát lokálisan, nagyon fontos helyen. A szerzők a jelen felmérésben 1-es és 2-es típusú cukorbetegek és egészségesek mosott thrombocytáinak NO-termelését vizsgálták élettanilag is fontos thrombocyta-stimulánsok (trombin, adrenalin, kollagén, ADP, ristomycin) hatására NO-szenzitív elektród segítségével. Eredményeik szerint mindkét diabetes típusban a thrombocyták NO-termelése csökken, illetve részben késve jelenik meg. A megfigyelés feltételezésük szerint arra utal, hogy a thrombocyták NO-generációjának zavara résztényező lehet a diabetesben észlelhető thrombocytatúlműködés és érszövődmények kialakulásában is.

Kulcsszavak: thrombocyta, EDRF-NO, diabetes mellitus, angiopathia

Reduced in vitro platelet derived EDRF-NO generation in human diabetes mellitus

Summary

There is a growing body of evidence, that intravascular EDRF-NO (NO) production is impaired in diabetes, which phenomenon may also contribute to the development of diabetic vascular disease. More recently the presence of inducible NO synthase (NOS) have been recognized in human platelets. Platelets produce NO only during activation, even though in minute amounts, this platelet derived NO seems to be important, as it appears to inhibit further platelet recruitment quite substantially. In the present report washed, isolated platelets, gained from healthy persons and Type 1 and 2 diabetics, were exposed to common and physiologically relevant activators (i.e. thrombin, ADP, epinephrine, collagen, etc.), and a specific electrochemical device developed for this purpose estimated NO production. In vitro platelet NO responses were reduced in each of the diabetic subjects, the speed of NO generation was also slow with some of the stimulants. One may assume, that blunted platelet NO response, at least in part, may contribute to platelet hyperfunction and angiopathy in diabetes mellitus.

Keywords: platelets, EDRF-NO, diabetes, diabetic angiopathy

   Diabetes mellitusban az intravascularis, jelentős részben endothelium eredetű EDRF-NO (továbbiakban NO) szintézise, valószínűleg a sejtek L-arginin (L-Arg)-felhasználási zavara miatt, csökken.^1,2,3 A rövid életű, hatásait tekintve Janus-arcúnak is mondott mediátor hiánya a vasodilatator és a thrombocyta-aggregációt gátló hatások gyengülését okozza, vélhetően leginkább a felgyorsult véráramlású szakaszokon, azaz a stenotikus érterületeken.⁴ Korábbi munkánkban összefüggést találtunk az intravascularis NO-képzés és a diabeteszes angiopathia, illetve a fokozott vérlemezkeműködés között.^1,2

   A 90-es évek közepén vált ismertté, hogy a celluláris struktúra tekintetében meglehetősen egyszerű vérlemezkék rendelkeznek NO-szintetáz (továbbiakban NOS) aktivitással.⁵ A biokémiai vizsgálatok kétféle NOS izoform jelenlétét is igazolták a thrombocytákban, egyfelől a kalcium-independens indukálható NOS-t, másfelől a kalcium/calmodulin függő endothelialis típusú ec-NOS-t.⁴ Az ec-NOS-t a thrombocyta-aggregáció stimulálja, s így a vérlemezke-aktiváció során NO képződik, amely az eddigi kísérleti adatok alapján a további thrombocyta-aktiváció fékezésére is képes.^6,7,8

   A thrombocyták NO-képzése mennyiségét tekintve rendkívül csekély, mérésére speciális NO-szenzitív elektród alkalmazására van szükség.⁹ Az in vitro felmérések alapján a nyugvó thrombocyták nem termelnek számottevő mennyiségben NO-t, míg kollagén-inger után NO-képződik.⁸ Az ADP-aktivációval kapcsolatos megfigyelések nem egyértelműek.⁶ Vannak kis számban klinikai megfigyelések is. Így uraemiában a thrombocyták NO-termelése fokozott, míg hypertoniában, migraine-ben, illetve súlyos coronariasclerosisban csökkenhet.^6,10,11

   A jelen tanulmányban egészséges kontrollszemélyek, valamint 1-es és 2-es típusú cukorbetegek izolált thrombocytáinak NO-termelését vizsgáltuk in vitro, elektrokémiai módszerrel az élettani szempontból fontos és a thrombocyta-aggregációs vizsgálatoknál rutinszerűen alkalmazott vérlemezke-aktiváló anyagokkal (thrombin, ADP, kollagén, adrenalin, ristomycin).

Betegek, anyagok, módszerek

   Vizsgált csoportok: az egészséges kontrollcsoport 13 normoglykaemiás önkéntes (klinikai munkatárs, 3 nő, 10 férfi, átlagos életkor 38,5+/-6,2 év) volt. Az 1-es típusú cukorbeteg csoportba tíz személy tartozott (7 férfi, 3 nő, átlagos életkor 22,3+/-4,1 év), míg a 2-es típusú diabeteszes csoport 12 betegből (9 nő, 3 férfi, életkor 62,3+/-11,4 év) állt. Egyik csoport tagja sem kapott nitrittartalmú gyógyszert, illetve a vizsgálatot megelőző tíz nap során a thrombocyta-működést vagy más antithromboticus hatású szert. Dohányos nem vett részt a vizsgálatban. A cukorbetegek többsége elfogadható metabolikus állapotú volt (HBA_1c: 6,9-9,7%), ketoacidosis, súlyosabb hyper- vagy hypoglykaemia esetében nem kerülhettek be a vizsgálati csoportokba.

   Mintavétel: a vénás alvadásgátolt vért (ACD [citrát] -oldat, Beckton-Dickinson) három ízben mostuk HEPES-pufferben (pH 7,4), majd a harmadik mosás után a vérlemezkéket 0,9%-os NaCl-ban reszuszpendáltuk.

   A mosott thrombocyta-szuszpenzió NO-termelésének mérése: a méréseket NO-szenzitív mikroelektrodájú, az in vitro celluláris NO-termelés mérésére kifejlesztett speciális készülékkel (ISONOP 200, ISO-NO WPI, Sarasota, Florida) végeztük. Az NO mennyiségének standardizálására a gyár által mellékelt SNAP donort használtuk, hat koncentrációt felvéve. Az eredményeket egységesen 100000 thrombocytára vonatkoztatva adtuk meg. L-Arg-tartalmú pufferben vizsgáltuk a vérlemezkék nyugalmi NO-képzését, s ezt alapvonalnak tekintve alkalmaztuk az aktivátorokat: kollagént (2,5 mg/ml), thrombint (3,1 mE/ml), adrenalint (0,25 mg/ml), ristomycint (31,5 mg/ml). A zárójelben a számok a mérőfolyadékban levő aktivátor végkoncentrációját jelzik. Minden esetben elvégeztük az inkubációt és a mérést az L-Arg kompetitív metabolikus inhibitorai jelenlétében is (így nem képződik NO), e célra a más közleményekben is alkalmazott L-NAME-t (nitro-L-arginin-metilészter), és az L-NNA-t (L-nitro-L-arginin) használtunk.⁹

   Az NO-termelődés a pikoamper (pA) nagyságrendű elektromos válaszként jelent meg az általunk alkalmazott thrombocyta-aktivátor rendszerben. A gyorsan emelkedő, majd tetőző áramerősség-változást a reakcióidő függvényében görbeként ábrázoltuk, s azt az enzimkinetikából jól ismert paraméterekkel jellemeztük: így V_max: az időegységre jutó pA-változás, a K_m a maximális válasz feléig eltelt idő. Az NO-termelés mennyiségi változásaira a V_max a jellemző (ezt illesztettük a SNAP standard pontokhoz), míg a képződés gyorsaságát a K_m-érték jelzi (értelemszerűen a nagyobb szám lassabb termelődésre utal).

1. ábra. A thrombocyták NO-képzése, az L-Arg specifikus inhibitorainak hatása A felső görbe az L-Arg pufferben kollagén után megjelenő thrombocyta NO választ jelzi, míg az alsó két görbe esetén a pufferben az L-Arg mellett L-NAME vagy L-NNA (az NO-szintézis kompetitív inhibitorai) volt. Látható, hogy az inhibitorok mellett nem alakul ki rendszerünkben NO-képződés

2. ábra. Jellegzetes thrombocyta NO-válasz vérlemezke-aktivátorokra (egészséges személy)

Eredmények

   A thrombocyták NO-válasza általában az aktivátor alkalmazását követő 20-40 másodpercen belül jelentkezett. Az 1. ábrán látható, hogy az L-Arg kompetitív antagonistái (L-NAME, L-NNA) jelenlétében NO-válasz nem jelenik meg.

   A 2. ábrán jól követhető az egyes aktivátorokra adott NO-válasz egészséges személy mosott thrombocytáiból készült szuszpenzióban.

   A 3. ábrán egy-egy cukorbeteg thombocytáinak tipikus NO-válaszgörbéi láthatók, melyek jól mutatják a vérlemezke NO-képzésének csökkenését mindkét diabetestípusban.

   Az 1. táblázatban a mosott vérlemezkékben a különféle ingerekre képződő, 100000 thrombocytára számolt átlagos NO-koncentrációt (nMol/l/100000 thrombocyta), valamint kinetikus paraméterként az átlagos K_m-értéket (ez abszolút értékében a reakció sebességével fordítottan arányos), valamint szórásaikat tüntettük fel. Az eredmények jelentős szórása ellenére 1-es típusú diabetesben a thrombocyták NO-termelése statisztikailag is jelentős (szignifikáns) mértékben csökkentnek bizonyult a kontrollcsoporthoz képest kollagénnel, ADP-vel, thrombinnal való ingerléskor. Adrenalin esetében a képződött NO mennyisége nem csökkent, de a képzés üteme szignifikánsan késedelmes, lassult. 2-es típusú cukorbetegségben a thrombocyták NO-képzésének mennyiségi zavara enyhébb, szignifikáns mértékű csökkenés a thrombin esetében észlelhető. Az adrenalin és a ristomycin esetében a képzés sebessége azonban e betegcsoportban is statisztikailag jelentős mértékben lelassul. Sajátos módon ADP után az NO-válasz gyorsabb a 2-es típusú cukorbetegekben, mint az egészségesekben. A szignifikáns különbségeket a táblázatban *-gal jelezzük.

3./a. ábra. Thrombocyta NO-képzési görbék diabetesben. 1-es típusú diabetes mellitus

3./b. ábra. Thrombocyta NO-képzési görbék diabetesben. 2-es típusú diabetes mellitus

1. táblázat. A thrombocyták NO-képzésének mennyisége (nmol/l/100000 thrombocyta) és sebessége (K_m) a vizsgált egészségesekben és cukorbetegekben

Megbeszélés

   A mosott, humán thrombocyták NO-képzése in vitro rendszerben, L-Arg jelenlétében elektrokémiai módszerrel megfelelően mérhetőnek bizonyult. A vérlemezke-aktiváció fiziológiás, s az aggregometriás módszerek esetében is kiterjedten, rutinszerűen alkalmazott ingerlő anyagainak különféle típusai, az általában diagnosztikusan is alkalmazott koncentrációk mellett a thrombocyták elektrokémiai módszerrel jól vizsgálható NO-válaszát váltották ki. A mosások után módszerünkkel a vérlemezkék NO-képzése megfelelően mérhető, az áramlási citometriás adatok alapján pedig a további mosás már nem javította a vérlemezke és az elhanyagolható mennyiségben levő egyéb alakos vérelemek arányát. Az NO-szintézis jól ismert, gyakran használt kompetitív metabolikus inhibitorait alkalmazva az NO-válasz több mint 95%-os csökkenése következett be, ami igazolja az NO-képzésre vonatkozó eredmények specifikus voltát (általában a 90%-os gátlás már elég a specificitás megállapításához⁸).

Az elvégzett vizsgálatok alapján tehető megállapítások az alábbiakban összegezhetők

1. Az általunk alkalmazott elektrokémiai módszer alkalmas annak a rendkívül csekély mennyiségű NO-nak a detektálására, amely a mosott vérlemezke aktivációja során keletkezik in vitro körülmények között.

2. Vizsgálataink megerősítik a tényt, hogy a nyugvó thrombocyták nem termelnek NO-t in vitro feltételek között.⁸

3. A thrombocytákban, in vitro rendszerben NO-termelés indukálható L-Arg jelenlétében és az aggregométerben is használt, aggregometriás koncentrációjú, élettanilag és kórélettanilag releváns stimulánsok hatására. Ez a válasz a legkisebb ADP után és a legszámottevőbb thrombin hatására. A válasz általában fél percnél már jelentős, 1 percnél megközelíti a maximális koncentrációt, nagyságrendjét tekintve néhányszáz nmol/l-t ér el 100000 thrombocytára vonatkoztatva.

4. Adataink arra utalnak, hogy a thrombocyták NO-válasza az in vitro rendszerben a cukorbetegség mindkét típusában csökkent. A jelenség okára csak feltételezések vannak, valószínű, hogy az LArg-hasznosulás diabetesben megjelenő zavarának lehet fontos patogenetikai szerepe.

   A ristomycin-válasz értelmezése annyiban más, hogy ez az antibiotikum nem élettani vérlemezke-inger, hanem a vérlemezke-adhézió, kitapadás szempontjából kiemelt fontosságú thrombocyta-von Willebrand-faktor kölcsönhatás vizsgálatára (így a Willebrand-betegség diagnosztikájára) is alkalmas anyag. Jól ismert, s indokolja a ristomycinnel végzett vizsgálatokat, hogy diabeteszes angiopathiában a plazma von Willebrandfaktorszintje jelentősen emelkedett.¹²

   A thrombinra, kollagénre adott válasz cukorbetegekben csökkent mennyiségű. Adrenalin után nem annyira a válasz nagysága csökken, hanem az NO-képződés időben válik késedelmessé. Ennek jelentősége lehet a thrombocyta-thrombus képződése vonatkozásában is. Az ADP-re adott válaszok összehasonlítása eleve nehéz az NO-válasz igen csekély volta miatt.

5. Az 1-es típusú cukorbetegségben a thrombocyták in vitro NO-válaszának csökkenése markánsabb, kifejezettebb mértékű a hasonló előjelű, de kisebb mértékű csökkenéshez képest, amelyet a 2-es típusú diabeteszesekből származó thrombocyták esetében észleltünk.

6. A vérlemezkék leírt NO-válaszának csökkenése szerepet játszhat a cukorbetegégben ismert, többszörösen dokumentált thrombocytatúlműködés kialakulásában, amelynek a jelenség eddig nem felismert, illetve azonosított kiváltó vagy súlyosbító tényezője lehet. Az adatsor új építőkő, elem lehet a diabeteszes angiopathia és a vascularis hematológia kapcsolatának elemzésében is. A kis esetszám nem ad alkalmat arra, hogy a diabetes tartama, az érszövődmények kiterjedtsége, súlyossága és a talált eltérések között összefüggések legyenek megállapíthatók.

   Természetesen az eredmények értékelése komoly kritikát és óvatosságot igényel, az alábbi okok miatt:

1. A vizsgálatok in vitro jellegűek, ezért valamennyi klinikailag releváns következtetés, hipotézisen alapul.

2. A thrombocyta-preparátum az ismételt mosás ellenére sem tekinthető teljesen tisztának. A további mosás vagy tisztítás azonban a thrombocyta-szám és -funkció vesztését eredményezte volna, a tisztaság már nem javult a mosások további ismétlése után.

3. A vizsgálat munkaigényes, bonyolult volta sem változtat azon, hogy az esetszám kicsi. Jelentős a különbség az életkor és nem tekintetében a csoportok között, melyek nem tekinthetők teljesen homogén módon összevethetőnek.

4. A légköri és a táplálkozási, ivóvízzel, esetleg gyógyszerrel történő nitritbevitel esetleges különbségei az in vitro NO-mérés eredményeit jelentősen torzíthatják, bár ezek a tényezők általában megtévesztően nagy NO-értékeket okozhatnak. A csökkent válasz nem lehet efféle artefactum eredménye. A nyugvó thrombocyta esetében nincs NO-produkció, s ez is a külső zavaró tényezők, artefactumok lehetősége ellen szólhat.

IRODALOM

1. Huszka M, Káplár M, Rejto L, Tornai I, Palatka K, László P, Udvardy M: The association of reduced endothelium derived relaxing factor-NO production with endothelial damage and increased in vivo platelet activation in patients with diabetes mellitus. Thromb Res 86: 173-180, 1997.

2. Udvardy M, Káplár M, Rejtő L, Tornai I, Palatka K, László P, Huszka M: Increased in vivo platelet activation and reduced EDRF-NO production in patients with insulin dependent diabetes mellitus. Platelets 9: 257-261, 1998.

3. Moncada, S, Palmer, R, Higgs, EA: Nitric oxide, physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol Rev 43: 109-142, 1991.

4. Sase, K, Michel, T: Expression of constitutive endothelial nitric oxide synthase in human blood platelets. Life Sci 57: 2049-2055, 1995.

5. Mehta, JL, Chen, LY, Kone, CB, Mehta, P, Turner, P: Identification of constitutive and inducible forms of nitric oxide synthase in human platelets. J Lab Clin Med 125: 370-377, 1995.

6. Berkels, R, Stockklauser, K, Rösen, P, Rösen, R: Current status on platelet NO synthases. Thromb Res 87: 51-55, 1999.

7. Freedman, JE, Loscalzo, J, Barnard, MR, Alpert, C, Keaney, JF, Michelson, AD: Nitric oxide released from activated platelets inhibits platelet recruitment. J Clin Invest 100: 350-356, 1997.

8. Radomski, MW, Palmer, R, Moncada, S: An L-Arg/nitric oxide pathway in human platelets regulates aggregation. Proc Natl Acad Sci USA 87: 5193-5197, 1990.

9. Malinski, T, Radomski, MW, Taha, Z, Moncada, S: Direct electrochemical measurement of nitric oxide released from human platelets. Biochem Biophys Res Commun 194: 960-965, 1993.

10. Gordge, MP, Neild, GH: Platelets from patients on hemodialysis show impaired responses to nitric oxide. Clin Sci 83: 313-318, 1992.

11. Cadwagn, TM, Benjamin, N: Evidence of altered platelet nitric oxide synthesis in essential hypertension. J. Hypertension 11: 417-420, 1993.

12. Rák K, Beck P, Udvardy M, Pfliegler Gy, Misz M, Boda Z: Plasma levels of beta-thromboglobulin and factor-VIII related antigen in diabetic children and adults. Thromb Res 29: 155-162, 1983.

A szerző levelezési címe: Dr. Udvardy Miklós

DEOEC, II. Belgyógyászati Klinika

4012 Debrecen, Nagyerdei krt. 98.